Для получения имеющих практическое значение антителосекретирующих гибридом используются лимфоидные клетки, выделенные из различных источ-ников, например, из селезенки или лимфатических узлов. При использовании для первичной иммунизации большинства чужеродных белков, полисахаридов и т. д. применяют следующую схему иммунизации: обычно вводят внутрибрю-шинно 1—100 мкг антигена, смешанного с равным объемом полного адъюванта Фрейнда (ПАФ). Затем с интервалом 2—3 недели проводят одну или более внутривенных инъекций данного антигена в физиологическом растворе. Через 1—2 дня после последней инъекции клетки селезенки выделяют и сливают с клетками выбранной миеломной линии. Более интенсивная и короткая схема иммунизации используется для получения гибридом из клеток лимфатических узлов. В этом случае мыши вводят подкожно в подушечки задних лап, паховые районы и в несколько точек вдоль позвоночника 10—300 мкг антигена в ПАФ. Через три дня процедуру повторяют, используя вместо ПАФ неполый адъюв ...

Описанная ниже схема слияния (рис. 28.3) — одна из тех, которые успешно используются во многих лабораториях. Применение полиэтиленгликоля в качестве сливающего агента широко используется благодаря его эффективности, простоте приготовления и воспроизводимости результатов. Другие схемыслияния могут отличаться от описанной по различным параметрам, однако существует одно общее правило: лучше использовать какую-то одну из них, а не сочетание нескольких.

1. Суспензии клеток селезенки или лимфатического узла, выделенных из иммунизированной мыши, получают стандартным способом в «ледяном» забу-ференном фосфатами физиологическом растворе.
2. Клетки миеломы выращивают в среде RPMI-1640, содержащей инакти-вированную нагреванием сыворотку эмбриона коровы {10—20%), пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (0,25 мкг/мл) и 2-меркап-тоэтанол (5х10-5М). Такая среда называется полной средой. Она же используется и для добавления ГАТ-ингредиентов, Клетки мие ...

Хотя большая часть этой главы посвящена обсуждению гибридом В-кле-точного происхождения, однако имеется много сообщений о Т-клеточных гибри-домах, полученных с помощью различных ГТФРТ-дефицитных Т-клеточных линий, например BW 1547 и EL4 [59—63].
Возможность создания и поддержания в культуре Т-клеточных гибридом, способных секретировать факторы, обладающие многими иммунологическими активностями, помогла выделить среди Т-клеток различные субпопуляции и детально охарактеризовать множество хелперных и супрессорных факторов. Не без основания надеялись, что получение непрерывно растущих Т-клеточных линий и гибридом с антигенной специфичностью, аналогичной специфичности некоторых антителопродуцирующих клонов, таких, как, например, ФХ-специ-фичных идиотип-положительных миелом ТЕРС15, позволит осуществить генетический анализ генов V, участвующих в синтезе антиген-специфичных Т-клеточных рецепторов. Пока между перестройками генов в антиген-специфичных гибридомах и линиях Т-клеток, о ...

Создание В-клеточных гибридом не только позволило производить специ-фические моноклональные антитела, но и помогло глубже понять генетические механизмы, обусловливающие разнообразие антител. Как говорилось в гл. 3, пре-В-клетки — первые идентифицируемые элементы В-клеточного ряда — обнаруживаются в эмбриональной печени млекопитающих. Поскольку популяция пре-В-клеток гетерогенна и немногочисленна, анализирвать иммуноглобу-линовый фенотип пре-В-клеток в том случае, когда они берутся из свежевы-деленной печени, довольно трудно [66]. В то же время, получив из пре-В-клеток гибридомы, можно вырастить клоны сравнительно редких клеток [66], что позволяет анализировать экспрессию иммуноглобулиновых генов и синтез иммуноглобулинов. Было показано, что в таких гибридомах гены FH перестроены, а гены FL — нет 167, 68J. Это наблюдение подтвердилось в опытах по изучению линий В-клеток, трансформированных вирусом Абельсона, откуда был сделан вывод, что при созревании В-клеток определенный ген Ун мож ...

Как уже говорилось при обсуждении общих вопросов, связанных с полу-чением гибридом, уникальным свойством моноклональных антител является их способность узнавать один эпитоп в сложной антигенной структуре. Этодает в руки экспериментатору мощное средство биологического анализа сложных структур, В то же время очевидно, что данное уникальное свойство моно-клональных антител повышает вероятность обнаружения неожиданного иммунологического перекреста. В последнее время появилось множество сообщений о моноклональных антителах, перекрестно реагирующих с неродственными молекулами. Было показано, что крысиные моноклональные антитела 41—21, полученные путем иммунизации крысы клетками мышиной Т-лимфомы, связываются с молекулой Thyl, а также с Ук-идиотипической детерминантой белка ТЕРС15 мышиной миеломы [97]. Моноклональные антиидиотипические антитела, направленные против фосфорилхолин (ФХ)-специфичного белка ТЕРС15, как оказалось, взаимодействуют еще и с С-реактивным белком человека (сыворот ...

Здесь дается лишь общее представление о методах скрининга гибридом и рассматриваются достоинства и недостатки каждого из них. Для более глубокого ознакомления с данным вопросом читатель отсылается к специальным методи-ческим работам [26—29]. Поскольку гибридомы секретируют относительно боль-шие количества антител, то простые, дешевые, удобные и экологически безопас-ные методы скрининга имеют предпочтение перед высокочувствительными.

В зависимости от того, как предполагается использовать моноклональные антитела, следует выбирать тот или иной способ скрининга. Например, если антитела предназначены для изучения антигена иммунопатологическими метода-ми, то для первоначального скрининга следует выбрать иммунофлуоресцент-ный анализ, а если антитела предполагается использовать в составе твердой фазы в радиоиммунном анализе, то именно этот метод, по-видимому, наиболее удобно использовать и для первоначального скрининга.

Если требуется получить антитела, напра ...

Для различных экспериментальных целей иногда бывает необходимо осуществить слияние В-клеток, принадлежащих двум клеточным линиям, одна (или обе) из которых не чувствительна к среде ГАТ. Для отбраковки несливших-ся клеток в этом случае обычно используют один из двух методов. Первый метод предполагает введение в предварительно выделенные ГГФРТ"-клетки маркера устойчивости к какому-либо другому агенту. Например, при слиянии клеток некоторых миеломных линий можно взять маркер устойчивости к уабаи-ну (ингибирующему (Ма++К+)-АТРазу). Если такие миеломные клетки слить с клетками другой линии в присутствии ГАТ и уабаина, выживут лишь гибриды, тогда как нормальные клетки погибнут [32]. Второй метод, описанный Райтом и Хайфликом [33] и использованный Барроузом и др. [34], заключается в обработке опухолевых клеток летальной концентрацией (2 мМ) иодацетамида непосредственно перед их слиянием с чувствительной к ГАТ миел омой. В этом случае будут выживать только опухолевые клетки, слившиеся с ми ...

С давних пор иммунологи, работавшие с опухолями, мечтали выявить у человека антигены, специфичные для опухолей. Использование монокло-нальных антител, обладающих точно известной специфичностью, дало возможность идентифицировать целый ряд антигенов, характерных, по-видимому, для определенных опухолей. Были описаны антитела, реагирующие с меланомными антигенами488], с клетками колоректальной карциномы [89], нейробластомы [90] и с антигенами, общими для различных видов лимфатической лейкемии [91]. Таков немногочисленный перечень моноклон ал ьных антител, выявляющих антигены, экспрессируемые в большей степени или исключительно на по-верхности опухолевых клеток.
Таким образом, использование моноклон ал ьных антител позволяет избе-жать проблем, связанных с применением обычных антител, индуцируемых опу-холевыми клетками, когда в ответ на антиген у животного появляется множество различных антител, реагирующих не только с опухолевыми антигенами, но также и с антигенами, экспрессир ...

В зависимости от того, каким образом планируется использовать монокли-нальные антитела, их можно выделять множеством различных способов.
При росте гибридом в культуре в супернатантах обычно содержится 10— 100 мкг/мл чистых моноклональных антител. Их можно использовать без допол-нительной очистки (возможно, после некоторого концентрирования) в качестве первых антител для непрямой флуоресценции или при иммунопреципитации. Если необходима дальнейшая очистка антител от присутствующих в культу-ральной среде сывороточных белков, то можно использовать аффинную хроматографию на сефарозе, конъюгированной с козьими или кроличьими антимышиными Ig или белком А. Если требуются большие количества антител, тогибридому можно выращивать в виде трансплантируемой опухоли у мышей гистосов-местимой линии. При этом необходимо предварительно (в период от трех дней до одного месяца до инъецирования) ввести мыши внутрибрюшинно 0,5 мл минерального масла, например пристана (Pristane — Aldrich Chemical, ...

Получение гибридомы включает в себя множество in vivo и in vitro этапов, а каждый дополнительный этап — это, как известно, еще один источник ошибок. По-видимому, наиболее часто неудачи в получении гибридом связаны с отступлением от устоявшихся методик работы с культурами тканей. Эти методи-ки предусматривают наличие должного внимания к качеству и чистоте использу-емой для культивирования посуды, стерильности сред, контролю за влажностью и рН в инкубаторах для клеток. Типы сыворотки, добавляемой в культураль-ные среды, также имеют важное значение, поскольку некоторые серии сыворотки плода коровы не способны поддерживать рост гибридных клеток. Многие фирмы поставляют сыворотку плода коровы, проверенную на способность под-держивать рост гибридом. Для проведения слияния и поддержания в культуре полученных гибридов используются цельная и очищенная от иммуноглобулинов лошадиные сыворотки [40], однако для получения первичных гибридом они обычно оказываются менее эффективными, чем сыворотка ...