Иммунная система способна давать имунный ответ на почти неограниченное число различных антигенов. Многочисленные антигенные детерминанты (эпитопы) каждого простого или сложного антигена (иммуногена) активируют множество клонов, начинающих продуцировать антитела с разной специфич-ностью, аффинностью и авидностью. В природе почти никогда не наблюдается истинный моноклональный ответ на антигены, хотя в ряде случаев в процесс антителообразования вовлекаются, вероятно, очень немногие В-клеточные клоны [21—23]. Конечно, хорошо известны примеры продуцентов моноклональных антител — это миеломы и другие опухоли В-клеток. Однако, несмотря на то, что такие клетки служат бесценным источником некоторых антиген-спе-цифических моноклональных антител, на практике чрезвычайно трудно получить миелому с заданной антигенной специфичностью [2, 24].

В 1976 г. Кёлер и Мильштейн детально описали метод слияния клеток, секретирующих антитела какой-то одной специфичности, с клетками непрерывно растущей миеломы [20]. Клон клеток, содержащих гены иммуноглобулинов, принадлежавшие как антителообразующей клетке, так и миеломе, наследовал от обоих антителообразующих родителей генетический материал, определяющий специфичность данных антител, а от непрерывно растущей миеломы — способ-ность к неограниченному росту.

Как показано на рис. 28.1, при иммунизации животного антигеном антитела, секретируемые множеством В-клеточных клонов, активированных различными эпитопами введенного антигена, появляются в виде гетерогенной смеси в иммунной сыворотке. Путем получения гибридом из клеток каждого эпитоп-специфического клона с последующим клонированием гибридов возможно разделить моноклональные антитела, специфичные к одним и тем же или разным эпитопам одного антигена. Таким образом удается получить набор моноклональных антител против различных эпитопов определенной молекулы, или иммуногена. Такие высокоспецифичные антитела могут быть использованы для исследования структуры и функции разных частей молекул, а также тех или иных типов клеток без предварительной иммуноадсорбции. Другое важное преимущество сводится к возможности наработки фактически неограниченного количества антител, обладающих не меняющимися со временем специфичностью и аффинностью.

Из рассмотренных в гл. 10 и 12 физиологических аспектов активации В-клеток вытекает целый ряд соображений о механизме формирования гибридом. Поскольку частота встречаемости антителообразующих клеток в иммунной селезенке низка [10~3—10~5), необходимо во всех случаях стараться максимально увеличивать число антиген-специфических В-клеток, способных к слиянию и образованию нормальных гибридов. Очевидно, что максимум синтеза антител (определяемых в сыворотке или путем подсчета бляшкообразующих клеток) не совпадает с максимумом образования специфических гибридов. По-этому особо важное значение приобретает подбор условий иммунизации и уста-новление в рамках выбранных условий оптимального времени слияния. По-види-мому, под влиянием полиэтиленгликоля (ПЭГ) предпочтительно сливаются пролиферирующие или активированные с помощью антигена В-клетки. Под-робно данный вопрос обсуждается в работе Паслея и Рузена [25]. Исходя из этого, следует использовать такую схему иммунизации, при которой слиянию подвергаются антиген-специфические клетки на той стадии дифференцировки, когда они пролиферируют или находятся в активированном состоянии (гл. 12).

Способы иммунизации, используемые при получении гибридом, как прави-ло, так сильно варьируют, что наиболее целесообразно предоставить читателю возможность самому ознакомиться с соответствующей литературой, где он, по-видимому, всегда найдет подходящее для себя описание условий иммуниза-ции, проводившейся с помощью какого-либо похожего антигена [26—29].

Идентификация клеток, продуцирующих антитела заданной специфичнос-ти,— это, пожалуй, самая важная процедура во всей гибридомной технологии. Поскольку новообразованные гибридомы могут быть нестабильны в отношении синтеза антител, желательно, чтобы методы раннего выявления отдельных анти-телообразующих клонов были быстрыми и простыми. Концентрация антител в лунках, содержащих гибридные клетки, обычно достаточно высока (10—100 мкг/мл). Поэтому чувствительность применяемых методов лимитируется, как правило, доступностью антигена. В настоящее время наиболее широкое распространение получили методы, основанные на реакции антиген—антитело,— радиоиммунологический анализ и(или) иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA) [26-31].

Обнаруженные антителообразующие клоны должны быть немедленно ре-клонированы. Необходимость быстрого реклонирования связана с тем, что после слияния во многих гибридах начинается «выброс» хромосом, продолжающийся до тех пор, пока число хромосом в клетке не станет равным приблизительно 2N. В ходе этого процесса некоторые клетки могут потерять хромосомы, несущие гены иммуноглобулинов. Существует опасность, что такие клетки, неспособные больше продуцировать иммуноглобулины, будут расти лучше антитело-образующих клеток клона. В зависимости от плотности посева клеток после гибридизации в каждую лунку может попасть более одного гибридного клона. В этом случае возникает необходимость отделить ненужные антителообразующие клоны от тех, которые представляют интерес для исследователя.