При использовании современных методов гибридизации частота слияния между клетками двух популяций оказывается относительно низкой (~ 1/104) лимфоидных клеток). Поэтому чтобы отделить гибриды от опухолевых клеток миеломы или лимфомы (они служат партнерами при получении В- и Т-гибридом соответственно), нужно убить неслившиеся клетки, которые составляют боль-шинство и которые в силу своей способности к быстрому и неограниченному росту in vitro будут неизбежно подавлять рост гибридных клеток. Обычно для этой цели применяется разработанный Литтлфилдом метод, основанный на предварительном выведении мутантных клеточных линий, дефектных по некоторым ферментам, участвующим в синтезе нуклеотидов [8]. В клетках мле-копитающих существуют запасные пути повторного включения предшественни-ков пуринов и пиридинов в синтез ДНК и РНК (рис. 28.2). Выделение мутантов, не способных к синтезу ферментов, ответственных за эту реинкорпорацию, осуществляется воздействием мутагенов на клетки миеломной линии с последу-ющим культивированием их в среде, содержащей токсичные аналоги азотистых оснований. Некоторые из таких аналогов и соответствующие ферменты приве-дены в табл. 28.1. В среде, содержащей токсичные аналоги, смогут выжитьтолько мутантные клетки, лишенные функционально активных указанных ферментов. С помощью таких сред можно выявлять, клонировать и в конечном итоге выделять клетки, дефектные по тимидин-киназе (ТК") или по гипоксан-тин-гуанозин—фосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ-, HGPRT").

Эти мутантные миеломные линии и служат партнерами для слияния, по-скольку на их фоне легко отобрать гибриды, если заставить клетки ТК" или ГГФРТ" использовать запасной путь синтеза нуклеотидов. Последнее достигается путем добавления в среду аналога фолиевой кислоты, аминоптерина, блоки-рующего нормальный путь синтеза пуринов и пиримидинов, как показано на рис. 28.2. В этом случае клетки миеломы оказываются вынужденными использовать запасной путь, но, будучи лишены одного из необходимых ферментов, погибают в среде ГАТ.
Генетические дефекты клеток мутантных линий никак не проявляются при росте таких клеток в нормальной среде, так как отсутствующие ферменты участвуют только в реакциях запасного пути синтеза нуклеотидов, а в нор мальных условиях в нем нет необходимости. Клетки же селезенки синтезируют полный набор ферментов запасного пути, так что гибриды, образовавшиеся при слиянии с ГГФРТ" или ТК~ миеломными клетками, продуцируют в результате достаточно ГГФРТ или ТК для того, чтобы выжить в среде ГАТ, содержащей гипоксантин и тимидин. Таким образом, в этой среде погибают несливгаиеся клетки миеломы, а их гибриды с нормальными клетками продолжают расти. Что касается нормальных В клеток, то in vitro они имеют лишь ограниченное время жизни, поскольку не трансформируются и не пролиферируют и вскоре гибнут.