В первое время наличие большого количества клеточных обломков, а также несинхронность гибели в среде ГАТ неслившихся миеломных клеток затрудняет обнаружение гибридных клеток. Однако через 7—9 дней начинают появляться небольшие кластеры клеток, имеющих типичную морфологию гибри-дом. Б зависимости от изначальной плотности клеток в рассеваемой смеси в каждой лунке может оказаться один или более кластеров. В этот период надо следить не только за ростом гибридов и изменением цвета среды в лунках, но также и за наличием зараженных лунок, которые необходимо соответствующим образом обрабатывать. При использовании 96-луночных планшетов через каждые 2—3 дня необходимо проводить «подкармливание». Для этого из каждой лунки следует отбирать половину среды и заменять ее равным объемом свежей полной среды.хВплоть до 14—21-го дня после слияния в среде должен содержаться ГАТ. Затем полезно постепенно разбавлять среду ГАТ, заменяя ее нормальной средой, ибо резкий переход от ГАТ к «чистой» среде может вызвать преждевременную гибель гибридных клеток. Когда кластеры гибридных клеток достигнут размера 2—3 мм в диаметре, супернатанты можно будет тестировать на наличие антительной активности. Иногда при использовании высокоиммуногенных антигенов при скрининге наблюдается высокий уровень фона, обусловленный антителами, синтезированными нормальными плазматическими клетками, которые не слились, но оказались в лунках на начальной стадии и продолжали секретировать антитела в течение нескольких дней после рассева. Эти остаточные антитела негибридомного происхождения можно удалить до проверки на активность, если при «подкармливании» хотя бы один раз полностью сменить среду и провести анализ через 1—3 дня — время, необходимое для того, чтобы в среде появилось достаточное количество антител, секретированных гибридомой. Тестирование гибридом на наличие антительной активности можно проводить различными способами (см. ниже), однако клоны, обнаруживающие соответствующую специфичность, необходимо реклонировать как можно раньше, а часть клеток исходного клона должна быть заморожена. Реклонирование требуется по уже известным причинам, связанным с возможностью «выброса» хромосом и необходимостью отделения ненужных клеток.
Для реклонирования можно использовать следующий путь: клетки сус-пендируют в полужидком агаре, и эту суспензию наносят на слой агара, содер-жащий фидерные клетки, с последующим отбором кластеров, образовавшихся из отдельных клеток. Тестирование реклонированных гибридом на активность антител производят после роста клонов в жидкой среде. Однако наиболее предпо-чтительный с точки зрения легкости и удобства метод — это клонирование путем лимитирующего разведения в 96-луночных планшетах. Он заключается в сле-дующем: клетки разбавляют и рассеивают их вместе с соответствующими фидер-ными клетками в такое количество лунок, чтобы рост гибридом наблюдался примерно в 1/3 лунок. Теоретически этого можно добиться, подсчитав количество клеток в исходной лунке и таким способом определив необходимое разбавле-
ние, однако такой подход не всегда дает хорошие результаты из-за наличия индивидуальных различий между гибридомами по эффективности роста, потреб-ности в фидерных клетках и т. д. Для того чтобы пробы отбирались лишь из лунок, получивших оптимальное количество клеток, успешно применяют сле-дующую эмпирическую схему.

1. Из полной среды RPMI-1640 готовят разбавляющую среду, содержащую перитонеальные фидерные клетки (5-104/мл), полученные от нормальной мыши соответствующей линии.
2. К 30 мл данной среды добавляют 1—2 мкл суспензии гибридомных кле-ток. Такое небольшое количество клеточной суспензии лучше всего переносить с помощью простерилизованных пластиковых наконечников.
3. Используя 5-миллилитровые пипетки или диспенсер, рассевают по 0,2 мл полученной смеси в лунку 96-луночного планшета.
4. В результате остается около 10 мл содержащей гибридомы среды, кото-рую снова разбавляют 20 мл полной среды и засевают другой 96-луночный планшет. Повторив эту процедуру 2—3 раза, можно быть уверенным, что па крайней мере в одном планшете клоны будут встречаться достаточно редко и чта в каждой лунке будет содержаться потомство лишь какой-то одной гибридомнои клетки.
После того как реклонированные гибридомы вырастут, супернатанты из лунок, содержащих клоны, снова тестируют на наличие антител и их специфич-ность. После выявления позитивной реклонированной гибридомы ее можна наращивать (опять же используя фидерные клетки) в культуральных флакона^ увеличивающихся размеров.