Специфичность антител (или антисыворотки) определяется по их способ-ности отличать антиген, против которого они были получены (гомологичный антиген, или иммуноген), от любого другого антигена. На практике невозмож-но проверить все антигены, поэтому обычно тестируют только отдельные антигены, имеющие что-то общее с иммуногеном. Специфичность, понимаемая таким образом, может быть определена только экспериментально и лишь для того набора антигенов, который был отобран для сравнения. Каруш [28] дал определение родственного термина — избирательности — как способности антител различать по принципу «все или ничего» два сходных лиганда. Таким образом, избирательность зависит не только от относительной аффинности антителак двум лигандам, но и от экспериментально найденной нижней границы обна-ружения взаимодействия. Например, антитела против какого-либо углевода, аффинность которых к данному иммуногену составляет 105 М-1, будут считаться высокоизбирательными, поскольку в 100 раз меньшая аффинность (103 М-1) к сходному углеводу экспериментально не обнаруживается. С другой стороны, антитела, связывающиеся с иммуногеном с аффинностью, равной 109 М-1, могут показаться менее избирательными, поскольку в 100 раз меньшая аффинность к сходному лиганду будет обнаруживаться довольно легко.

В отличие от избирательности, иммунологический перекрест определяется как способность взаимодействовать со сходными лигандами, отличными от иммуногена. Чаще всего этот термин употребляется по отношению к лиганду. Иными словами, если антиген Y связывается с антителами, полученными против антигена X, то говорят, что Y перекрестно реагирует с X. Отметим, что в указанном смысле перекрестно реагируют друг с другом антигены, а не антитела. Тем не менее перекрест двух антигенов X и Y может быть определен лишь по отношению к данным конкретным антителам или конкретной антисыворотке. Например, может оказаться, что какая-то другая группа антител против X совсем не взаимодействует с Y, так что по отношению к этим антителам Y не будет перекрестно реагировать с X. Можно использовать тот же термин еще в одном смысле, говоря, что некоторые антитела против X перекрестно реагируют с антигеном Y.

В большинстве случаев перекрестно реагирующие лиганды имеют к данным конкретным антителам более низкую аффинность, чем иммуноген. Однако имеются и исключения, когда перекрестно-реагирующие антигены связываются с антителами с более высокой аффинностью, чем собственно иммуноген. Это явление называется гетероклитичностъю, а антиген, обладающий большей аффинностью к антителам, чем иммуноген,— гетероклитичным. Антитела, проявляющие такие свойства, также называются гетероклитичными. Хорошим примером гетероклитичных антител служат антитела мышей линии C57BL/10, полученные против гаптена нитрофенилацетата (НФ). Эти антитела, как показали Мекеле и др. [53], связываются с перекрестно реагирующим гаптеном нитро-иодофенилацетилом (НИФ) с более высокой аффинностью, чем с НФ.

Во многих реальных ситуациях наличие иммунологического перекреста обнаруживается методом преципитации, например преципитацией в агаре (метод Ухтерлони), гемагглютинации (описание обоих методов см. ниже) или сходных методов. Все эти методы характеризуются неспособностью отличать разницу в аффинности от разницы в концентрации, что в сочетании с гетерогенностью иммунных сывороток по составу привело к неоднозначности в употреблении терминов иммунологический перекрест и специфичность. С появлением РИА данная неоднозначность в терминологии, а также в интерпретации получаемых результатов стала очевидной.

Учитывая это, Берзофски и Шехтер [54] недавно предложили различать два типа специфичности и, соответственно, два типа реакций иммунологического перекреста, соответствующие двум различным кривым конкуренции в РИА, изображенным на рис. 23.11.
Иммунологическим перекрестом первого типа, или истинным перекрестом, называется способность двух лигандов связываться с разной аффинностью с одним и тем же участком на одной и той же молекуле антитела. Например, похожие гаптены динитрофенил (ДНФ) и тринитрофенил (ТНФ) могут с различной аффинностью реагировать с антителами, полученными к ДНФ. В белковых антигенах подобное различие может возникать при небольжих изменениях первичной последовательности (например, при консервативной замене треонина на серии) или при изменении конформации (например, при расщеплении белка на фрагменты) (рис. 23.12). Если пептидный фрагмент содержит все контактирующие остатки антигенной детерминанты (т. е. все те остатки, которые контактируют с антигенсвязывающим центром антитела), то он, в принципе, мог бы взаимодействовать с антителами, полученными против нативной детерминанты, хотя и с меньшей, чем нативный белок, аффинностью (уменьшение аффинности обусловлено тем, что конформация пептида будет отличаться от нативной). Явление иммунологического перекреста первого типа проиллюстрировано на рис. 23.11 (кривая, конкурента СА).Видно, что при достаточно высоких концентрациях немеченого СА метка будет полностью вытеснена из комплексов с антителами. Однако в этом случае для вытеснения определенной части метки требуется более высокая концентрация лиганда, чем в случае иммуногена L.

Иммунологическим перекрестом второго типа, или частичным перекрестом, называется способность перекрестно реагирующего лиганда взаимодействовать с некоторой субпопуляцией антител в гетерогенной сыворотке. Следовательно, данный тип иммунологического перекреста возможен лишь тогда, когда популяция антител гетерогенна (что, однако, справедливо для большинства обычных антисывороток). В этом случае аффинность перекрестно реагирующего лиганда может оказаться не меньше, чем аффинность иммуногена, т. е. кривая, описывающая вытеснение метки из комплексов с антителами, совсем не обязательно должна сдвигаться вправо. Следует, однако, заметить, что при перекресте второго типа данная кривая будет выходить на плато не при полном вытеснении метки (рис. 23.11, кривая конкурента Св). В качестве примера рассмотрим белок, имеющий детерминанты X и Y.
Пусть антисыворотка против него содержит как антитела против X, так и антитела против Y. Тогда для мутантного белка, в котором детерминанта Y изменена настолько, что уже не может узнаваться антителами против Y, а де-терминанта X осталась неизменной, будет иметь место иммунологический перекрест второго типа. Такой мутантный белок сможет конкурировать с белком дикого типа только за антитела против X (возможно, даже с той же аффин-ностью), но не за антитела против Y.
Если для определения концентрации комплексов антиген—антитело ис-пользуются вторичные реакции, то правило, согласно которому иммуноло-гический перекрест второго типа может иметь место, лишь когда антисыворотка гетерогенна, иногда нарушается. В случае, когда при изучении реакции антиген—антитело участвуют вторичные реакции, например в опытах Шарона и др. [59] и Цизара и др. [60], в реакции гомогенных миеломных или гибри-домных антител с декстранами плато появлялось на уровне, меньшем чем 100%-ное связывание. Следует, однако, заметить, что в данных случаях исполь-зовался метод количественной преципитации, в котором наличие такого плато может объясняться, например, неодинаковой растворимостью различных комплексов. Если бы было возможно наблюдать взаимодействие антиген— антитело прямо в растворе, не прибегая к помощи какой-либо вторичной реак-ции, способной искажать конечные результаты, то в случае гомогенного антигена и гомогенных антител плато реакции или ее торможения теоретически не могло бы появиться на уровне, меньшем чем 100%. Поэтому, когда подобное плато возникает, оно, по-видимому, должно быть обусловлено вторичными реакциями конкуренции.
Конечно, оба типа иммунологического перекреста могут наблюдаться одновременно. Проанализируем возможность этого на примере все того же пептидного фрагмента, который мы использовали при обсуждении иммуно-логического перекреста первого типа. Пусть в состав фрагмента, хотя бы и не в нативной конформации, входят остатки, формирующие детерминанту X, и не входят остатки, относящиеся ко второй детерминанте Y, также присутствующей на поверхности нативного белка. Если в антисыворотке к натив-ному белку содержатся антитела к каждой из детерминант, то пептид будет конкурировать лишь за связывание с антителами против X (иммунологический перекрест второго типа), обладая даже по отношению к ним меньшей аффинностью, чем нативный белок. Вследствие этого кривая конкуренции сдвинется вправо и выйдет на плато до того, как будет достигнуто полное вытеснение х.
В случае гомогенных (например, моноклональных) антител, у которых возможен лишь иммунологический перекрест первого типа (или «истинный» перекрест), с помощью графика, аналогичного обсуждавшемуся выше графику зависимости B/F от F, можно количественно определить различие в аффинности по отношению к разным перекрестно реагирующим лигандам. Предположим, что лиганды X и Y способны взаимодействовать с некими монокло-нальными антителами, полученными к лиганду (т. е. X и Y перекрестно реаги-
руют с L). Если построить графики зависимости отношения концентраций связанного и свободного радиоактивно меченного лиганда L (B/F = R) от логарифма концентрации конкурирующего лиганда (соответственно X или Y), то при определенных условиях (см. ниже) две кривые конкуренции окажутся параллельными (рис. 23.13). Условие заключается в том, чтобы концентрация

свободной метки была меньше, чем 1/Кь(Кь — аффинность радиоактивноме-ченного лиганда L). В этом случае можно показать [54], что в срединной точке графика, т. е. когда R — RJ2, будет справедливо следующее приближенное равенство:
Кх - -ШЦ- , (41)
где Кх — аффинность антител к X. Данное равенство аналогично уравнению (21), если в качестве немеченого иммуногена взять конкурирующий лиганд. Кроме того, по аналогии с уравнением (23) можно показать, что если вместо концентрации свободного лиганда [Х]своб взять общую концентрацию конкурента [Х](, то в уравнении (41) появится дополнительный член:

[X], (при R = RJ2) =

*х

[S],

(42)

Таким образом, если концентрация конкурирующего лиганда отложена в линейном масштабе, то разность концентраций, соответствующих срединным

точкам двух кривых, будет равна 1/ЛГх — 1/ЛСу безотносительно к тому, что отложено по оси абсцисс — общая концентрация лиганда или концентрация свободного лиганда. В то же время лишь во втором случае отношение концентраций, соответствующих срединным точкам, будет равно Кх.1К^. Данное замечание оказывается существенным, если по оси абсцисс отложен логарифм концентрации конкурента (а именно так обычно и строят этот график), поскольку в данном случае величина горизонтального смещения двух кривых соответствует отношению концентраций [X]/[Y], а не разности между ними (54].
Если выполнено и второе условие, а именно что концентрация связанной метки должна быть малой по сравнению с концентрацией антигенсвязываю-щих участков [S]f, то наклон в срединной точке (т. е. когда R — RJ2) графика, в котором концентрация отложена в линейном масштабе, будет пропорционален аффинности данного конкурента Кх или KY [54]. (Оба условия выполняются одновременно, когда концентрация меченого L мала относительно как ЛГь, так и ES]*.) Если [Х]своб и [Y]CBO6 отложены в логарифмическом масштабе, то наклоны кривых окажутся равными (т. е. кривые будут казаться параллельными), поскольку линия, сдвинутая на графике с логарифмической шкалой параллельным переносом на т единиц вправо, будучи построенной в линейном масштабе, во всех точках пойдет в 1/т раз круче.
Если антитела гетерогенны по аффинности, то кривые будут уширяться и в общем случае они окажутся непараллельными. Следует подчеркнуть, что в том случае, когда антитела обладают гетерогенностью по специфичности и имеется иммунологический перекрест второго типа, частичное вытеснение метки, достигаемое при выходе на плато графика зависимости B/F от концентрации свободного конкурирующего лиганда, не будет пропорционально доле антител, взаимодействующих с конкурентом, но окажется пропорциональным их взвешенной доле, в которой концентрации антител взвешены по их аффинности к меченому антигену [54].
Существование двух типов иммунологического перекреста приводит к необ-ходимости введения двух соответствующих определений специфичности [54]. Количественной мерой специфичности первого типа служит относительная аффинность данных гомогенных антител к иммуногену и к любому из пере-крестно реагирующих лигандов. Если аффинность антител к иммуногену ока-зывается значительно выше, чем к любому из тестируемых перекрестно реа-гирующих лигандов, то про такие антитела говорят как об высокоспецифических, т. е. хорошо отличающих данный лиганд от других. Если аффинность антител к перекрестно реагирующим лигандам оказывается ниже чувствительности метода, то, как уже обсуждалось [28], специфичность первого типа проявляется как избирательность. Специфичность можно даже определить как отношение величин аффинности антител к иммуногену и к перекрестно реагирующему лиганду [61]. Именно специфичность первого типа большинство иммунохимиков называет истинной специфичностью, точно так же как иммунологический перекрест первого типа — истинным перекрестом.
Общепринятое использование понятия «иммунологический перекрест», включая сюда частичную реактивность или реактивность второго типа, для описания явления частичного перекреста привело ко второму определению специфичности, применяемому только к гетерогенным популяциям антител^ таким как антисыворотки. Подобную специфичность мы называем специфично-стью второго типа. Если все находящиеся в смеси антитела связываются с иммуногеном, но лишь небольшая их доля взаимодействует с каким-либо перекрестно реагирующим антигеном, то про антисыворотку говорят, что она
относительно специфична к иммуногену. Отметим, что не имеет значения, будет ли аффинность субпопуляции антител, которые взаимодействуют с перекрестно реагирующим антигеном, высокая или низкая (иммунологический перекрест первого типа). До тех пор, пока эта субпопуляция составляет малую часть всех антител, смесь будет оставаться специфичной. Таким образом, специфичность второго типа зависит от относительных концентраций антител в гетерогенной антисыворотке, а не только от величин их аффинности. Отметим также, что данные относительные концентрации субпопуляций антител можно использовать для сравнения специфичности какой-либо антисыворотки к двум перекрестно реагирующим лигандам. Однако было бы бессмысленным сравнивать специфичность двух различных антисывороток по отношению к одному и тому же лиганду путем сравнения долей антител в каждой сыворотке, реагирующих с данным лигандом. Хотя понятие специфичности второго типа может показаться менее фундаментальным, чем понятие специфичности первого типа, именно специфичность второго типа непосредственно измеряется в таких методах анализа, как, например, двойная диффузия в агаре по Ухтерлони. В других случаях, например при гемагглютинации (см. ниже), оба типа специфичности могут проявляться в равной степени. Кроме того, необходимо подчеркнуть, что понятие специфичности второго типа естественным образом приводит к описываемой далее концепции полиспецифичности.