Перед тем как закончить раздел, посвященный обработке данных РИА, необходимо указать несколько способов контроля и внесения поправок, без которых результаты могут оказаться ошибочными.

Во-первых, в любом методе, использующем преципитацию антител и свя-занного с ними антигена (или использующем антитела, пришитые к твердой фазе), всегда может существовать фракция антигена, осаждающаяся или свя-зывающаяся неспецифически в отсутствие специфических антител. Поэтому для определения неспецифического или фонового связывания всегда необходимо проводить контрольные эксперименты по связыванию с неиммунной сывороткой (или с другим эквивалентным контрольным препаратом). Неспецифическое связывание обычно линейно возрастает с увеличением дозы антигена. Фракция антигена, обусловливающая такое связывание, должна составлять одну и ту же часть в препаратах как немеченого, так и меченого антигенов, т. е. не может вызывать насыщения. Полученное в этом контрольном эксперименте значение величины связывания следует вычесть из В, а величину F, если она определялась независимо, следует при этом оставить без изменений. Если же F определяется как разность между Т и В (для меченого антигена), то F изменится, поскольку Т в этом случае тоже должно быть скорректировано на величину неспецифического связывания. Другими словами, значение суммарной концентрации антигена представляет собой сумму концентраций связанного специфически и свободного антигена. Весь антиген, который связался неспецифически, следует вычесть из всех выражений, в которые он входит.

Вторая поправка, возможно, менее очевидная, чем первая, связана с нали-чием радиоактивной метки, не связанной с иммунологически активным анти-геном. Во многих случаях меченый антиген загрязнен радиоактивным изотопом, находящимся либо в свободном состоянии, либо в ассоциации с денатури-рованным антигеном (который, возможно, и денатурировал именно в процессе радиоактивного мечения) или с антигенно неактивной примесью в препарате антигена. Чтобы определить, какая часть радиоактивного материала специфи-чески взаимодействует с антителами в данном конкретном случае, можно ис-пользовать раствор с постоянной концентрацией меченого антигена, добавляя в него все увеличивающиеся количества антител. Если загрязнения иммуноло-гически неактивным материалом нет, то при достаточно большой концентрации антител вся радиоактивность должна оказаться связанной. Если же при повы-шении концентрации антител количество метки, связавшейся с антителами, выходит на плато на уровне, меньшем, чем 100%, то лишь эта часть и будет иммунологически активной. Насколько важно вносить поправки на иммуноло-гически неактивную фракцию, можно показать на следующем примере. Предпо-ложим, что часть метки, являющаяся иммунологически активной, составляет лишь 80%, а неактивной — 20%, и пусть истинное значение величины B/F в какой-то точке равняется 3, т. е., согласно уравнению (39), B/F = 0,75. Эти величины относятся лишь к иммунологически активной фракции метки, т. е.
к 80% метки. Оставшиеся 20%, которые не связываются, будут ошибочно включены в свободную метку, и в результате концентрация свободной метки получится в два раза больше реальной. Это приведет к тому, что рассчитанное значение B/F окажется равным 1,5 (т. е. 0,6/0,4) вместо 3 (0,6/0,2). Такая разница в два раза свидетельствует о существенном различии между истинным значением аффинности и получаемым, например, с помощью анализа Скэтчар-да. Кроме того, в этом случае в графике Скэтчарда на участке, соответствующем большим значениям B/F, будет появляться плато, поскольку если 20% метки всегда остаются в свободном состоянии, то B/F никогда не сможет превысить 4 (т. е. 0,8/0,2). Для внесения потенциально весьма существенной поправки на данный эффект необходимо всякий раз определять концентрацию иммунологиче-ски неактивной метки в каждой партии антигена и вычитать ее из F и Т. Если В и F измеряются независимо, а Т вычисляется как их сумма (а не просто равняется общей концентрации антигена, включая немеченый конкурирующий антиген), то удобный способ вносить поправки без каких бы то ни было предположений относительно величины Т сводится к следующему: вычисляют отношение В/Т = В/ (В + F), вносят поправку путем деления на долю метки, являющуюся иммунологически активной (в приведенном выше примере эта доля равнялась 0,8) и затем определяют B/F, используя уравнение (38).