Основное, что определяет чувствительность метода,— это аффинность антител, концентрация антител и меченого антигена, а также точность (вос-производимость) получаемых данных. В целом при более высокой аффинности можно добиться большей чувствительности. Если же антитела обладают очень высокой аффинностью, то это будет ограничивать диапазон, в пределах которого можно варьировать другие параметры. Например, поскольку в ходе эксперимента находящийся в исследуемом образце немеченый антиген конкурирует с меченым, то утверждение о том, что чем ниже концентрация метки, тем меньшую концентрацию антигена в неизвестном образце можно измерить, будет справедливо лишь до определенного предела. Этот предел, как следует из приведенных выше теоретических рассуждений, определяется величиной аффинности Касс [36]. Самый крутой участок кривой титрования соответствует концентрациям, близким к 1/Касе. При концентрациях лиганда, значительно меньших 1/Касс, большинство антигенсвязывающих участков остается незанятым, вследствие чего конкуренция оказывается менее эффективной. Поэтому нет никакого смысла уменьшать концентрацию метки до такого уровня, при котором К&сс превышает ее более чем в несколько раз. Следовательно, хотя в целом увеличение удельной радиоактивности меченого антигена и уменьшение его концентрации представляется полезным, однако при этом важно помнить о существовании предельного значения концентрации 1/Касс. Увеличение удельной радиоактивности, более чем это необходимо для достижения макси-мальной чувствительности, может приводить к денатурации антигена, а слиш-ком сильное ее уменьшение будет неизбежно вызывать неудобства, связанные с удлинением времени счета.

Аналогичным образом понижение концентрации антител будет до опре-деленного предела приводить к увеличению чувствительности. Этот предел также зависит от значения 1/Касс и от величины фонового «неспецифического связывания». Ясно, что уменьшение концентрации антител до того значения, когда связывание метки в отсутствие немеченого антигена становится слишком близким к уровню фона, будет приводить к потере чувствительности вследствие понижения точности. В целом условия эксперимента должны быть такими, чтобы часть метки, связанной в отсутствие конкурента, была больше, чем 0,2 и как можно ближе к 0,5 (см. [44]).

Удобный способ получения оптимальных концентраций метки и антител заключается в следующем. Прежде всего необходимо определить наименьшую концентрацию метки, которая дает требуемую точность счета за достаточно удобное время счета и точность счета при связывании от половины до десятой части всей метки. Затем, оставляя данную концентрацию метки постоянной, следует в отсутствие конкурента разбавить антитела настолько, чтобы отно-шение концентраций связанного и свободного антигена стало бы близким к 1,0 (тогда отношение концентраций связанного и суммарного антигена будет равно 0,5). При данных концентрациях антитела и метки чувствительность обычно оказывается близкой к оптимальной с точностью в пределах описанных выше границ. Важно иметь в виду, что при изменении концентрации метки для получения оптимальной чувствительности необходимо соответственно изменить и концентрацию антител.