Проведение РИА в растворе имеет то преимущество, что связывание в этом случае определяется истинной аффинностью антител. Однако при этом связанный и свободный антигены должны быть разделены способом, который не нарушает равновесия. Подходы, используемые для этого, относятся к трем основным типам: осаждение антител со связанным антигеном, когда свободный антиген остается в растворе, осаждение свободного антигена, когда в растворе остаются антитела и связанный антиген, и, наконец, разделение свободных и связанных с антителами молекул антигена в растворе по размеру с помощью гель-фильтрации. Последний способ слишком трудоемок, чтобы его можно было использовать, когда необходимо исследовать большое количество образцов. К тому же он оказывается настолько медленным, что в ходе эксперимента равновесие может нарушиться. В связи с этим колоночная гель-фильтрация в РИА почти не применяется.

По-видимому, наиболее широко используются методы, в которых осаж-даются антитела. Если антиген значительно меньше, чем антитело (мол. масса <30 кДа), то с помощью сульфата аммония [39] или полиэтиленгликоля с мол. массой 6000 Да (10% по весу) [40] (а именно эти реактивы наиболее часто используются для данной цели) можно осадить практически все антитела, тогда как антиген будет оставаться в растворе. Например, осаждение полиэтиленглико-лем и центрифугирование, могут быть проведены в течение менее чем 2 мин, что дает возможность разделить связанный и свободный антигены раньше, чем произойдет сколько-нибудь значительная диссоциация, обусловленная эффектом разбавления вследствие добавления полиэтиленгликоля [41]. Отметим, что если используется не цельная сыворотка, то для образования макроскопического осадка необходимо добавить в качестве неспецифического носителя гамма-глобулин. Однако если мол. масса антигена значительно больше 30 000 — 40 000 Да или если антиген не имеет формы глобулы, то полиэтилен-гликоль в концентрациях, полностью осаждающих антитела, может также осадить более 10% свободного антигена, что в результате будет приводить к неприемлемо высокому уровню фона (неспецифического связывания в отсутствие специфических антител). В этих условиях необходимо использовать более специфические методы осаждения. Если антитела исходно относятся к некоему подклассу иммуноглобулинов G, связывающихся со стафилококковым белком А, то можно воспользоваться преимуществом высокого сродства белка А к IgG, взяв для осаждения антител либо сефарозу с пришитым к ней белком А, либо убитые формалином целые клетки стафилококков (штамм Cowan I). Поскольку и гранулы сефарозы, и клетки стафилококков представляют собой большие частицы, их можно легко осадить центрифугированием, а вместе с ними и анти-тела со связанным антигеном, тогда как свободный антиген при этом останется в растворе [42]. Если и эта процедура не удастся, то можно попытаться осадить антитела, используя специфичные вторые антииммуноглобулиновые антитела, полученные путем иммунизации животных другого вида. Этот метод применяется очень широко, однако он также весьма громоздок. Как будет показано ниже, максимальное осаждение происходит не в условиях избытка антител, а в «точке эквивалентности» — в середине кривой титрования, где антиген (в данном случае первые антитела) и антитела (антииммуноглобулиновые) находятся примерно в одинаковых концентрациях. Поэтому для достижения максимального эффекта надо определить точку эквивалентности путем титрования с помощью вторых антииммуноглобулиновых антител, а для поддержания концентрации иммуноглобулинов на постоянном уровне следует добавить иммуноглобулиновый носитель. Необходимо, однако, иметь в виду, что реакция преципитации идет весьма медленно, поскольку формирование преципитацион-ной сетки и образование агрегатов, достаточно больших для того, чтобы их можно было осадить, протекает значительно медленнее, чем собственно реакция антиген—антитело. В результате инкубация со вторыми антителами обычно занимает от 24 до 48 ч или даже больше, по сравнению с несколькими секундами, требуемыми для осаждения полиэтиленгликолем. Столь долгое время инкубации не только задерживает получение результатов, но приводит также к тому, что равновесие между антигеном и антителами, сдвигаемое вследствие разбавления реагентов при добавлении вторых антител, устанавливается на новом уровне. Поскольку при уменьшении концентраций уменьшается также образование комплексов (см. выше), чувствительность метода понизится, если увеличение объема образца, обусловленное добавлением вторых антител, не будет сведено к минимуму. Некоторые из этих трудностей могут быть преодо-лены повышением эффективности осаждения с помощью низких концентраций полиэтиленгликоля.

Другой метод разделения заключается в адсорбции свободного антигена на поверхности какого-либо реагента, так, чтобы антиген, связанный с антителами, оставался при этом в растворе. Наиболее широко для этой цели используются активированный уголь и тальк. Поскольку способность связываться с данными реагентами зависит от размеров и гидрофобности антигена, активированный уголь и тальк могут использоваться для адсорбции лишь некоторых антигенов. Описанный метод недорог и достаточно быстр. Однако, чтобы получить с его помощью воспроизводимые результаты и избежать при этом адсорбции комплексов антиген—антитело, необходимо точно устанавливать и внимательно следить за рН, ионной силой и температурой. Более того, поскольку активированный уголь и тальк обладают высоким сродством к антигену, они могут конкурировать за связывание с ним с низкоаффинными антителами и тем самым сдвигать положение равновесия. Кроме того, так как активированный уголь является гасителем ^-излучения в сцинтилляционной жидкости, его можно использовать лишь в том случае, когда для мечения берутся у-излучаю-щие изотопы, например