Любая антигенная детерминанта белковой природы определяется не только тем, какие аминокислотные остатки входят в ее состав, но и тем, как они при этом располагаются в трехмерном пространстве. Поскольку эти остатки находятся на поверхности белка, их взаимное расположение в пространстве можно называть топографией антигенной детерминанты. Сёла [89] разделил белковые антигенные детерминанты на две группы — на зависимые в основном от аминокислотной последовательности или от конформации. В то же время, поскольку антигенсвязывающий центр в составе нативного антитела имеет одну из энергетически предпочтительных топографии, представляется вероятным, что некоторые конформации полипептидной цепи антигена будут лучше соответствовать антигенсвязывающему центру, чем другие, и, следовательно, будут связываться более эффективно. Отсюда можно сделать вывод, что конформация или топография в определенной степени имеют важное значение для любой антигенной детерминанты.

Более того, как видно из атомной модели поверхности белка, очень трудно установить направление полипептидной цепи и положение спиралей (ср. рис. 23.16 и 23.17), а также определить, являются ли сближенные в пространстве остатки соседними в самой цепи, или же они относятся к удаленным друг от друга участкам последовательности и оказались рядом лишь в результате свертывания полипептидной цепи. Если при связывании с антителом белок сохраняет свою нативную конформацию, то и антитело не сможет различать соседние и удаленные по цепи остатки. Поэтому вероятность того, что антигенные свойства данной детерминанты нативного глобулярного белка определяются лишь последовательностью аминокислот, оказывается довольно малой. Даже в том случае, когда большая часть детерминанты представляет собой непрерывную последовательность, все равно другие, находящиеся рядом остатки тоже должны влиять на связывание. И лишь в том случае, когда белок перзд иммунизацией расщепляют на фрагменты, есть определенные основания считать, что соответствующие детерминанты окажутся зависимыми от последовательности.

Хотя имеются данные о том, что подобное «созревание» (расщепление на фрагменты) антигена происходит при узнавании его Т-клетками, тем не менее в громадном большинстве остальных случаев антитела образуются именно на нативную конформацию антигенных детерминант, если в качестве иммуно-гена используется нативный белок. Например, было показано, что антитела к нативной стафилококковой нуклеазе обладают по отношению к иммуногену примерно в 5000 раз большей аффинностью, чем к соответствующему поли-пептиду, который был пришит к сефарозе и использовался для их выделения [95]. Еще более яркий пример антител к нативному миоглобину и к апомиоглоби-ну приводит Крамптон [96]: при связывании антител, полученных против нативного ферримиоглобина с миоглобином, наблюдается образование коричневого осадка, свидетельствующее о том, что в белке сохранился гем, причем его окружение близко к нативному, но эти же самые антитела были неспособны прочно связываться с апомиоглобином, не содержащим гема и находя-щимся в несколько отличной от нативного мйоглобина конформации. С другой стороны, при добавлении к нативному (коричневому) миоглобину антител, направленных против апомиоглобина, получается осадок белого цвета. Эти антитела настолько сильно предпочитают не содержащую гема конформацию апомиоглобина, что с их помощью можно фиксировать состояние тех молекул, которые случайно оказались в этой конформации, и, таким образом, сдвигать равновесие в сторону апоформы. Фигурально выражаясь, антитела как бы вытесняют гем из мйоглобина. С термодинамической точки зрения это означает, что предпочтение антител к апоформе по сравнению с нативной формой обусловлено большей свободной энергией связывания белка с антителом, чем с гемом. Подводя итог, можно сказать, что при иммунизации образуются антитела, весьма специфичные к конформации белка, используемого в качестве яммуногена.

Миоглобин, кроме того, представляет собой удобный объект для изучения широкого спектра антигенных детерминант, начиная от сравнительно зависимых от последовательности и кончая существующими лишь в нативной конформации белка (рис. 23.16). Типичной детерминантой первого типа является участок последовательности, находящийся в N-концевой части молекулы и включающий остатки 15—22. Впервые Крамптон и Уилкинсон ,[97] обнаружили, что получаемый в результате расщепления химотрипсином фрагмент, содержащий остатки 15—29, связывается с антителами, направленными как против нативного, так и против апомиоглобина. Затем две группы исследователей показали, что синтетические пептиды, соответствующие более короткой последовательности 15—22, связываются с антителами, получаемыми против нативного мйоглобина кашалота, даже несмотря на то, что содержат лишь 7—8 остатков [91, 98]. Пептиды такой длины не могут, находясь в растворе, в течение длительного времени пребывать в конформации, соответствующей конформации данного участка в составе нативного белка. С другой стороны, аффинность антител к этим пептидам оказывается в несколько сотен раз ниже, чем к нативному белку. Таким образом, даже несмотря на то, что последовательность 15—22 составляет большую часть детерминанты, тем не менее антитела оказываются значительно более специфичными (в смысле специфичности первого типа) по отношению к фрагменту, имеющему нативную конформацию, чем к пептиду со случайной конформацией. Кроме того, не исключено, что в построении данной детерминанты принимают участие другие остатки, находящиеся рядом на поверхности мйоглобина, но не входящие в данную последовательность *.

Ярким примером, подтверждающим важную роль вторичной структуры антигенной детерминанты в узнавании ее антителами, служит пептид, пред-ставляющий собой петлю в лизоциме куриного яйца (остатки 64—80) [103]. Эта петля образована дисульфидной связью между цистеиновыми остатками Cys-64 и Gys-80, и, как было показано, служит основной антигенной детерминантой лизоцима [103]. Содержащий данную петлю пептид 60-83, будучи выделенным в свободном состоянии, связывает антитела с высокой аффинностью,
однако «открывание» петли путем расщепления дисульфидной связи приводит к исчезновению большей части антигенной активности по отношению к анти-лизоцимным антителам [103].

На другом полюсе требований, предъявляемых к конформации полипептидной цепи, лежат детерминанты, составленные из удаленных друг от друга по первичной структуре остатков, оказавшихся сближенными вследствие свертывания полипептидной цепи. Примеры таких, называемых топографическими, детерминант также имеются в миоглобине. Из шести различных изученных Берзофским и др. [13, 90] типов моноклональных антител к миогло-бину кашалота ни одни антитела не связывались ни с каким из фрагментов,
получаемых при расщеплении белка с помощью бромциана и составляющих вместе полную молекулу. Следовательно, эти моноклон а л ьные антитела (все они имеют аффинность от 2« 10s до 2• 109 М-1) высокоспецифичны по отношению именно к нативной конформации. Затем данные антитела были исследованы путем сравнения величин их относительной аффинности к ряду выделенных из различных видов животных нативных миоглобинов, аминокислотные последовательности которых были известны. Использование таких миоглобинов позволило идентифицировать некоторые остатки, участвующие в связывании с антителами трех из шести данных типов. Удивительным оказалось то, что два из этих трех типов антител узнавали топографические детерминанты (в том смысле, в котором они были определены выше). Антитела первого клона узнавали детерминанту, включающую в себя остатки Glu 4 и Lys 79, входящие соответственно в состав А-спирали и колена E-F, но находящиеся на расстоянии 2 А друг от друга и образующие в нативной молекуле солевой мостик (рис. 23.17). Антитела другого клона узнавали детерминанту, включающуюв себя остаток Glu 83, располагающийся на колене E-F, а также остатки А1а-144 и Lys-145, принадлежащие Н-спирали (рис. 23.18). Опять же, эти остатки удалены друг от друга в аминокислотной последовательности, но вследствие свертывания полипептидной цепи оказались в нативной конфор-мации сближенными на расстояние 12 А. Аналогичные данные недавно были получены для моноклональных антител, направленных против миоглобина человека [104] и лизоцима [105]. Кроме того, в некоторых случаях существование подобных конформационно-зависимых антигенных детерминант было предположено на основе результатов исследований, проведенных с помощьюполиклональных сывороток, специфичных к таким белкам, как инсулин [106], гемоглобин [107], белок вируса табачной мозаики [108] и цитохром с [109].

Насколько часто в поликлональных антисыворотках встречаются антитела, специфичные к топографическим детерминантам по сравнению с антителами, связывающимися с одним протяженным фрагментом полипептидной цепи? Этот вопрос изучали Ландо и др. [110], пропускавшие козьи, бараньи и кроличьи антисыворотки к миоглобину кашалота через колонки с сефарозой, на которой были иммобилизованы фрагменты, полученные в результате расщепления миоглобина с помощью бромциана и составляющие вместе всю пос-ледовательность молекулы. Антисыворотки пропускались последовательно и повторно через каждую из трех колонок до тех пор, пока адсорбция антител не прекращалась. Однако после такой процедуры в каждой из сывороток 30—40% первоначально присутствовавших антител оставались несвязанными. Эти антитела тем не менее обладали высокой аффинностью по отношению к нативной молекуле миоглобина, но, как было показано с помощью РИА, не связывались в растворе ни с одним из фрагментов. Таким образом, во всех четырех тестируемых антимиоглобиновых сыворотках от 60 до 70% антител могли связываться с пептидами, а от 30 до 40% — только с белком, имеющим ин-тактную нативную конформацию.

На основе результатов, полученных в серии подобных исследований, было предположено, что значительная часть поверхности любого белка способна проявлять антигенные свойства [111]. При этом поверхность можно разделить
на отдельные антигенные области [90, 101, 102, 104], каждая из которых состоит из многих перекрывающихся детерминант, узнаваемых различными антителами.

Анализируя результаты описанных выше исследований, можно сделать еще одно интересное предположение, касающееся топографии антигенных детерминант белковой природы. На стереоизображении (рис. 23.18) видно, что составляющие антигенную топографическую детерминанту остатки 83, 144 и 145 миоглобина кашалота располагаются по разным сторонам глубокой щели или впадины на поверхности белка. Не исключено (хотя это пока и не доказано), что в антигенсвязывающем центре антитела имеется комплементарная выпуклость, которая при взаимодействии антитела с антигеном попадает в эту впадину. На основе данных по изучению миеломных белков, связывающих небольшие гаптены или углеводы, принято считать, что антиген заполняет собой некоторую полость или трещину на антителе [112]. Однако в случае антигенов, представляющих собой глобулярные белки, ситуация оказывается структурно более симметричной (а связывание антигена с антителом является к тому же и термодинамически симметричным). В результате обе модели, в одной из которых выпуклость на антителе соответствует впадине на антигене, а в другой, более традиционной, наоборот, впадина на антителе соответствует выпуклости на антигене, становятся равновероятными. В настоящее время, когда можно получить моноклональные антитела против любых антигенов белковой природы, по-видимому, будут обнаруживаться оба типа комплементарности. Не исключено, что именно наличие у детерминанты, изображенной на рис. 23.18, впадины, как раз и обусловливает узнавание этой детерминанты антигенсвязывающим центром антитела.

Более полная информация по данному вопросу содержится в специальных обзорах [89, 96, 112].