Мы уже обсуждали тот факт, что антитела, полученные против нативного белка, обладают более высокой аффинностью к нативной, чем к какой-либо другой конформации, принимаемой полипептидной цепью в результате фраг-ментирования или денатурации. Аналогичным образом антитела, полученные против фрагментов или денатурированных молекул, имеют большую аффинность именно к ним, а не к нативной конформации белка. В данной части мы обсудим возможные механизмы возникновения подобных различий в аффин-ности и выясним, каким образом такие различия можно использовать при изучении конформационного равновесия в белках и пептидах.

Предложено несколько механизмов, с помощью которых можно объяснить, почему антитела, специфичные к нативному белку, связываются с пептидным фрагментом, находящимся в случайной конформации, с более низкой аффинностью. Конечно же, в пептиде могут отсутствовать некоторые из остатков, входивших в состав антигенной детерминанты и контактировавших с антителом. Поэтому естественно, что энергия связывания его с антителом будет меньше. Однако существуют и другие механизмы, за счет которых аффинность пептида к антителам может уменьшаться даже в тех случаях, когда в пептиде присутствуют все контактирующие остатки. Во-первых, взаимное расположение этих остатков может не столь хорошо соответствовать структуре анти-генсвязывающего центра антитела, как у белка, находящегося в нативной конформации. Во-вторых, не исключено, что функциональная аффинность оказывается пониженной из-за того, что в каждый момент времени лишь не-большая часть молекул пептида имеет конформацию, близкую к нативной. В данной модели предполагается, что антитела связываются только с теми молекулами, которые находятся в нативной конформации. Поскольку такие молекулы составляют лишь ПК часть всех молекул пептида (К — константа конформационного равновесия пептида), то в соответствующее число раз уменьшится и величина функциональной аффинности (см. ниже). Эта модель по сути аналогична аллостерической модели. В-третьих, возможно, что при первоначальном связывании антитела с пептидом, находящимся в ненатив-ной конформации, имеет место неполная комплементарность. Однако затем вследствие внутримолекулярных изменений пептид переходит в состояние минимума энергии и принимает конформацию, близкую к нативной. Данная гипотеза, называемая гипотезой промежуточного состояния, аналогична модели индуцированного соответствия. Уменьшение аффинности в ней обус-ловлено тем, что для изменения конформации пептида требуется определенная энергия, от величины которой зависит значение константы конформацион-ного равновесия, фигурирующей во второй гипотезе. Какая из этих моделей справедлива в действительности, можно с некоторой степенью достоверности выяснить с помощью кинетических экспериментов, поскольку первая гипотеза предсказывает более высокие скорости «прямой» и «обратной» реакций, чем вторая.

Хотя с помощью второй гипотезы невозможно объяснить все имеющиеся данные, тем не менее она оказалась полезной, поскольку на ее основе был предложен метод оценки констант конформационного равновесия в белках и пептидах [95, il4j. Исходя из этой гипотезы, можно записать:
Таким образом, отношение значения наблюдаемой константы ассоциации антитела с пептидом к константе ассоциации антитела с нативной молекулой должно равняться константе конформационного равновесия пептида. Необ-ходимо отметить, что в данном случае полная концентрация пептида принимается приблизительно равной [Псл]. Обычно это предположение оказывается справедливым, поскольку для большинства пептидных фрагментов лишь незначительная их часть находится в нативной конформации, т. е. величина ^конф=Шн]/[Псл] оказывается много меньше единицы. Кроме того, надо сказать, что если в какой-то степени верны первая или третья гипотезы, то получаемое с помощью данного метода значение КК0Нф будет завышенным. С другой стороны, если меньшая аффинность пептида обусловлена отсутствием некоторых контактирующих с антителом остатков антигенной детерминанты, то величина KK(m$ окажется заниженной (поскольку в данном методе пред-полагается, что все различие в аффинности обусловлено конформационными эффектами). Две эти ошибки могут до некоторой степени взаимно скомпенси-роваться. Полученная с помощью данного метода величина КК0Нф одного из пептидных фрагментов стафилококковой нуклеазы -оказалась равной 2«Ю-4 [95]. Использование антител, специфичных к этому фрагменту, дало возможность оценить, какую часть времени нативная нуклеаза проводит, находясь в ненативной конформации. В данном случае она оказалась близкой к 1/3000.