Существует еще одна твердофазная система, позволяющая изучать реакции антиген—антитело. В основе ее лежит так называемый иммуноферментный анализ (ИФА) [50J. В принципе единственное отличие ИФА от РИА заключается в том, что антитела и антиген вместо того, чтобы связываться с радиоактивным изотопом, ковалентно пришиваются к какому-либо ферменту, после чего определяется связанная ферментативная активность (а не связанная радиоактивность). Растущая популярность ИФА объясняется безопасностью и удобством работы с нерадиоактивными материалами, а также широ-ким распространением специальных спектрофотометров, с помощью которых за одну минуту можно измерить поглощение в 96 лунках. Поскольку и в ИФА« и в РИА действуют одни и те же термодинамические ограничения, а присутствие фермента может быть обнаружено, если он находится в том же диапазоне моляр-ных концентраций, в котором обычно используются радиоактивные изотопы, то чувствительность и избирательность обоих методов оказываются сравнимыми. Мы рассмотрим четыре основных схемы применения ИФА для обнаружения специфических антител, антигена или перекрестно реагирующих антител.

На рис. 23.9А показана схема непрямого ИФА, представляющего собой простейший способ обнаружения специфических антител в исследуемой анти-сыворотке и измерения их* концентрации. Антиген нековалентно связывается со стенками каждой лунки пластикового планшета для микротитрования. Именно поэтому оказалось удачным, что большинство белков неспецифично сорбируется на пластик. Избыток свободного антигена отмывается, а лунки инкубируют с раствором альбумина, блокирующего оставшиеся свободными участки неспецифического связывания белков. Затем добавляется тестируемая антисыворотка, и молекулы специфических антител связываются с иммобили-зованным на твердой фазе антигеном. При последующей отмывке удаляются несвязавшиеся антитела.

После этого добавляются связанные с ферментом антитела против имму-ноглобулинов, узнающие связавшиеся с антигеном специфические антитела. Несвязавшиеся конъюгаты антиглобулин-фермент отмываются, после чего добавляется субстрат. В результате действия фермента на субстрат появляется окрашенный продукт, обнаруживаемый спектрофотометрически по увеличению поглощения.

Хотя данный метод является быстрым и весьма чувствительным, с его помощью часто бывает трудно получить количественные характеристики. В пре-делах определенного диапазона концентраций увеличение оптической плотности пропорционально количеству специфических антител, добавленных на первом этапе. Однако количество связанных антител измеряется не прямо, поскольку концентрация антител в образце оценивается путем сравнения со стандартной кривой, построенной для известного количества антител. Столь же трудным представляется определение с помощью этого метода аффинности антител, так как иммобилизованность антигена на твердой фазе приводит к повышению функциональной аффинности. Для обнаружения очень малых количеств антител, чувствительность данного метода оказывается вполне удовлетворительной, особенно когда в качестве связанного с ферментом реагента используются аффинно очищенные антитела к иммуноглобулинам. Одни и те же связанные с ферментом антитела против иммуноглобулинов можно использовать для регистрации антител ко многим различным антигенам. В то же время антитела к определенным классам иммуноглобулинов могут быть использованы для выяснения того, в какой степени специфический иммунный ответ обусловлен иммуноглобулинами каждого из классов. Очевидно, что воспроизводимость метода зависит от степени однородности покрытия антигеном стенок каждой из лунок (этот параметр может варьировать), а специфичность зависит от используемого для покрытия стенок очищенного антигена.

На рис. 23.9, Б показан метод обнаружения антигена, основанный на конкуренции. На первом этапе растворенный антиген смешивают с огра-ниченным количеством специфических антител. Затем смесь добавляют в лунки, стенки которых покрыты антигеном, и обрабатывают так, как показано на рис. 23.9, А . Образование комплексов антиген—антитело на первом этапе будет приводить к снижению количества адсорбировавшихся на стенках антител и, следовательно, к уменьшению поглощения, измеряемого на конечном этапе. Описанный метод позволяет найти аффинность свободного антигена, определяемую половиной тормозящей концентрации антигена. Кроме того, при использовании данной схемы можно оценить степень перекреста между антигеном, находящимся в растворе и на стенках лунки.

На рис. 23.9, В показан используемый для обнаружения антигена так называемый метод «сэндвича». Стенки пластиковых лунок покрывают специфи-ческими антителами, связывающимися затем с антигеном. После этого добавляют вторые антитела, сшитые с ферментом. Они связываются с комплексами антиген—антитело, вследствие чего молекулы фермента оказываются иммобили-зованными на твердой фазе. Далее избыток вторых антител отмывают, после чего добавляют субстрат. Измеряемое в этом случае поглощение будет определяться концентрацией антигена в тестируемом растворе, значение которой можно будет определить с помощью стандартной кривой. Специфичность данного метода зависит от специфичности антител, адсорбированных на стенки лунки и используемых для обнаружения антигена. Чувствительность же определяется значениями аффинности и количеством находящихся на стенках первых антител, которое можно увеличить, если на этапе адсорбции использовать аффинно очищенные антитела. Возможность одновременного связывания антигена с антителами обоих типов зависит от того, является ли антиген бивалентным. Если же он моновалентен, то первые и вторые антитела должны обладать специфичностью к различным антигенным детерминантам одной и той же молекулы антигена. В том случае, когда эти антитела связываются с одной мономерной молекулой антигена и представляют собой два различных клона моноклональных антител, с помощью данного метода можно выяснить, могут ли эти антитела одновременно связываться с одной и той же молекулой или же они конкурируют за один участок или за различные, но настолько близкие друг к другу участки, что одновременное связывание невозможно из-за стерических препятствий [51].

На рис. 23.9, Г показано, как метод «сэндвича» может быть использован для обнаружения перекреста антител. Сначала стенки лунки покрывают антигеном 1, после чего добавляют антитела, которые специфично с ним связываются. Избыток антител отмывают и добавляют антиген 2, сшитый с ферментом. Если связавшиеся антитела перекрестно реагируют и с антигеном 2, то связанный с ферментом антиген 2 будет также сорбироваться на твердой фазе. Количественно это будет проявляться как увеличение поглощения в результате проведения катализируемой ферментом реакции. Данный метод был использован для изучения перекрестных реакций антиидиотипических сывороток с двумя препаратами идиотина, а также для обнаружения анти-антии-диотипических антител (см. гл. 9 и 22). Возможны и другие варианты взаимного расположения антител и антигена. Наличие в «сэндвиче» дополнительных слоев может приводить к повышению чувствительности, однако оно вызывает увеличение фона и вариабельность получаемых результатов.

Примером использования первой из описанных выше схем служит обна-ружение человеческих антител к вирусу гриппа [52] (см. рис. 23.10). Лунки,, располагающиеся в соседних колонках планшет, покрывались поочередно вирусом гриппа и бычьим альбумином. Разбавленную в 10 раз сыворотку добавляли в два верхних ряда лунок каждой пары колонок и последовательно разбавляли четырехкратно в направлении сверху вниз. Последняя окрашенная лунка указывает на титр, а отсутствие окрашивания в лунках, покрытых аль-бумином, свидетельствует о специфичности. Еще одно использование этого метода связано со скринингом супернатантов культур при получении моно-
клональных антител. Чувствительность и скорость метода ИФА делает воз-можным его использование для скрининга большого количества образцов при получении специфических антител. Клоны, отобранные по этому методу, обычно имеют высокое сродство к антигену. Возможно, это обусловлено диссоциацией антител с низкой аффинностью при отмывке.