Точно такое же увеличение сродства, какое имеет место при многоцентровом связывании, наблюдается и в двухфазных системах. Примерами взаимодействий такого типа служат реакции поливалентных антител с антигеном, прикрепленным к клеточной или искусственной поверхности (например, к се-фарозе или к стенкам пластиковых пластинок для микротитрования), реакция поливалентных лигандов с антителами, находящимися на поверхности В-кле-ток, гранул сефарозы или на стенках пластиковых лунок, а также реакция любого из компонентов с преципитатом антиген-антитело. По причинам, изложенным выше, «моногамное» взаимодействие может приводить к тому, что наблюдаемая аффинность поливалентного антитела или антигена к твердой поверхности, имеющей много участков узнавания, окажется очень большой и связывание станет практически необратимым.Однако существует еще один эффект, также приводящий к увеличению наблюдаемой аффинности в двухфазной системе и имеющий место даже в слу- л чае моновалентных антител (Fab-фрагментов) или моновалентных лигандов. Этот эффект связан с тем, что на поверхности локальная эффективная концентрация связывающих участков оказывается во много раз выше концентрации такого же числа участков, распределенных по всему объему раствора [31]. Иными словами, данный эффект обусловлен тем, что на границе твердого тела и жидкости нарушается высказанное при обсуждении константы ассоциации Касс предположение, что реагенты распределены по всему объему случайно (до некоторой степени это учитывалось, когда мы говорили об увеличении аффинности поливалентных реагентов). Данная ситуация была проанализирована в работах ДеЛизи[32], а также ДеЛизи и Вигеля [33], которые разбили реакцию на два этапа — диффузионный процесс, необходимый для того, чтобы сблизить реагенты на требуемое расстояние и установить в правильной ориентации, и собственно реакцию. Комплекс антиген-антитело, в котором реагенты находятся в соответствующем положении, но еще друг с другом не реагируют, называется ориентированным комплексом. Тогда можно записать реакцию

S + D i+S...D^=SD, (33)

где S — это связывающий участок антитела, D — антигенная детерминанта, к+ и к_ — константы скорости прямой и обратной диффузии, а ^ и к_± — константы скорости прямой и обратной реакций в том случае, когда ориентированный комплекс уже образован. Если концентрация ориентированных комплексов не меняется со временем, то полные константы скорости будут задаваться уравнениями

Af = /c1/t+/(ft1 + ft_),
кг = к^кЛкх + к_),

где индексы f и г относятся к прямой (forward) и обратной (reverse) реакциям [32]. Константа ассоциации, согласно уравнению (7), представляет собой от-ношение этих двух констант, т.е. ОТ Соотношение между величинами к1 и к_ определяет предположительную судьбу ориентированного комплекса, показывая, какой процесс более вероятен — реакция с образованием SD или же распад комплекса на свободно диф-фундирующие Реагенты.

Предположим, что к_ мала по сравнению с kt. Тогда связанный комплекс SD и ориентированный комплекс S .... D могут много раз превращаться друг в друга, до того как ориентированный комплекс распадется и один из реагентов перейдет в раствор. Если на поверхности имеется много антигенных детерминант D, то даже для моновалентного антигена (Fab) в случае диссоциации SD до S ... D может оказаться значительно легче вновь вступить в реакцию с той же самой или соседней детерминантой, чем перейти в раствор (возможность этого опять-таки определяется относительными величинами констант скорости к{ и к2). Именно в большей вероятности снова вступить в реакцию с поверхностью, чем перейти в раствор, и заключается описываемый эффект. Более подробное математическое описание реакций на поверхности клеток дано у ДеЛизи [32], а также у ДеЛизи и Вигеля [33].
Несколько отличный от предыдущего, но представляющий значительный
интерес анализ того же самого или очень похожего явления провели Силхеви и др. [34]. Эти авторы изучали случай диффузии лиганда из диализного мешка, содержащего белок, к которому лиганд имеет значительное сродство. Когда концентрация лиганда становится настолько низкой, что свободные участки связывания на поверхности белка оказываются в избытке, то скорость выхода лиганда из диализного мешка перестает быть просто скоростью диффузии или просто скоростью диссоциации комплексов белок—лиганд. Авторы показывают, что в данных условиях выход лиганда представляет собой реакцию квазипервого порядка, хотя время полужизни при этом оказывается в (1 -f- [Р] Касс) раз больше, чем в отсутствие белка:

*+ = М1 + 1Р]*асо). (37)
где [Р] — это концентрация лигандсвязывающих участков, Касс — аф-финность, a t+ и t_ — время полужизни в присутствии и в отсутствие белка в диализном мешке соответственно.

В описанном случае белок находился в растворе, так что авторы могли ис-пользовать действительную концентрацию белка и действительную истинную аффинность Касс. Если же белок находится на какой-нибудь двухмерной поверхности, то вопрос о том, что считать эффективной концентрацией, становится сложнее. Однако можно принять, что высокая локальная концентрация белка, заключенного в диализном мешке, аналогична высокой локальной концентрации белка, присоединенного к твердому носителю. Поскольку в основе обоих явлений лежит по существу один и тот же механизм, можно предположить существование сходных эффектов. Например, в случае диализа присутствие в умеренной концентрации 10 мкм антител с аффинностью 108 М-1 может уменьшать скорость выхода лиганда в тысячу раз. В результате диализ, который в противном случае занимал бы тры часа, теперь будет идти четыре месяца! Легко понять, что из-за такого «задерживающего эффекта» даже не очень высокие значения аффинности будут казаться бесконечными, а реакции будут производить впечатление необратимых. Данный задерживающий эффект возникает не только в иммунологических, но и в других системах — например на клеточной поверхности или между клеточными компартментами, где локальная концентрация белка может быть высокой.

В заключение необходимо подчеркнуть следующее: поскольку описанные эффекты задержки зависят от наличия большого количества незанятых участ-ков связывания, добавление значительного избытка немеченого лиганда для насыщения этих участков будет приводить к уменьшению или исчезновению эффекта задержки и к существенному ускорению диссоциации или выхода меченого лиганда. Такое действие немеченого лиганда может быть исполь-зовано в качестве теста на наличие задержки, хотя необходимо иметь в виду, что в определенных случаях тот же самый эффект может служить указанием на наличие отрицательной кооперативное™ между различными лигандсвязы-вающими участками.