Мы уже знаем, как оцределить аффинность с помощью графиков зависимости отношения концентраций связанного и свободного лигандов от концентрации связанного лиганда (график Скэтчарда), свободного лиганда или суммарной концентрации лиганда. Последняя зависимость представляется особенно полезной для обработки данных по конкуренции, получаемых с помощью РИА. Независимой переменной должна быть всегда суммарная концентрация о антигена, поскольку она является именно тем известным параметром, при варьсвязанного (bound), свободного (free) и суммарного (total) антигена как В, F и Т соответственно. Мы уже видели, что для определения аффинности Касс более удобен график зависимости B/F от F, чем от Т. Однако с помощью РИА определяется именно Т, и поэтому независимой переменной при построении стандартной кривой должна быть тоже Т. Другое отличие ситуации, имеющей место при РИА, от ситуации, которую мы обсуждали ранее, заключается в том, что в первом случае в реакционной смеси присутствуют меченый и немеченый антигены. Зависимой переменной является отношение концентраций связанной и свободной метки B/F, поскольку лишь концентрации меченых реагентов могут быть измерены в РИА непосредственно. Значение B/F для немеченого антигена в условиях равновесия должно быть точно таким же, как и для меченого, если допустить, что тот и другой связываются с антителами одинаково (т. е. с одной и той же К&сс). Это допущение не всегда правомерно и требует экспериментальной проверки. Даже если оно окажется неверным, все же с помощью стандартной кривой можно определить неизвестные концентрации, однако любой более детальный анализ становится сложным.

На рис. 23.6 видно, что график зависимости B/F от F или Т в том случае, когда F или Т («доза») отложено в логарифмическом масштабе, имеет S-об-разную форму. То же самое должно быть справедливо для графика зависимости В/Т от F или Т. Отметим, что поскольку В + F = Т, то
Эти преобразования могут оказаться полезными. Если на графике зависимости B/F или В/Т от F или Т независимая переменная отложена в линейном масштабе, то кривая по форме будет напоминать гиперболу (см. рис. 23.7). График за-висимости B/F от логарифма Т был первым способом представления данных,полученных с помощью РИА. Тем не менее и до сих пор он остается одним из самых информативных. Максимальная чувствительность РИА достигается в условиях, соответствующих наибольшему наклону кривой.

С помощью вероятностного анализа было показано, что, если антиген имеет несколько детерминант, каждая из которых способна связываться с антителом независимо от другой, то чем больше таких детерминант на молекуле антигена может одновременно взаимодействовать с антителами, тем сильнее будет наклон кривой [45]. Такой эффект связывания с несколькими детерминантами обусловлен тем, что в РИА молекула антигена считается связанной, если к ней присоединена хотя бы одна или несколько молекул антитела, а свободной лишь в том случае, когда она вообще не связала антител. Поэтому вероятность того, что данная молекула антигена окажется свободной, равна произведению вероятностей того, что каждая из ее детерминант будет свободной. Данный эффект может приводить к значительному увеличению наклона кривой, что было подтверждено экспериментально [45].

Представить данные в виде прямой во многих случаях позволяет так назы-ваемое логит-преобразование [46, 47]. Чтобы его использовать, сначала в каждой точке вычисляют отношение В/В0, где В0 — это концентрация связанной метки в отсутствие конкурента. Затем проводят логит-преобразование полученного отношения, используя следующую формулу:

Логит (Y) = In (-JL-)

где In означает натуральный логарифм (т. е. логарифм по основанию е). График зависимости логит (В/В0) от In Т, как правило, представляет собой прямую (рис. 23.8). В простейшем случае, когда моноклональные антитела связывают моновалентный антиген, наклон этой прямой обычно равен —1. Очевидно, что представление результатов в виде прямой оказывается весьма полезным при графической интерполяции, которую проводят для того, чтобы с помощью стандартной кривой определить концентрацию антигена. Дополнительное преимущество данного представления заключается в том, что при сравнении прямых линий облегчается тест на параллельность. Если неизвестный антиген идентичен антигену, использованному для получения стандартной кривой, то в координатной системе логит-log кривая, соответствующая исследуемому антигену, будет параллельна стандартной кривой (конечно же, параллельность кривых не гарантирует идентичности антигенов). Если же антигены не иден-тичны, то данный тест использовать нельзя.